Mikel Andoni Arriola Peñalosa




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Preparación: Ajustar el pH si es necesario. Calentar a ebullición para disolver el agar. Enfriar a 48- 55 ºC.

*Solución concentrada de colorante


Azul de bromotimol

4,0 g

Rojo de cresol

4,0 g

Etanol al 95%

100 mL


Para un color consistente en el medio, usar una solución de colorante en vez de repetidas pesadas del colorante en polvo. Disolver los colorantes en etanol para tener una solución concentrada al 4 % (P/V). Adicionar 1 mL de esta solución por cada litro de agar mCPC para obtener 40 mg de azul de bromotimol y 40 mg de rojo de cresol por litro.

Solución 2


Celobiosa

10 g

Colistina

400,000 unidades

Polimixina B

100,000 unidades

Agua destilada

100 mL


Disolver la celobiosa en agua destilada con calentamiento suave. Enfriar. Adicionar los antibióticos.

Adicionar a la solución 2 enfriada a la solución 1, mezclar y distribuir en cajas petri. El color final es verde oscuro a verde-café.

Nota: Este medio como el TCBS, es muy inhibitorio y no requiere esterilización.

Este medio debe ser almacenado a 4 ºC por no más de 2 semanas

Este medio se prepara por ingredientes

B.18.7.10 Solución Salina Reguladora de Fosfatos (PBS)


NaCl

7,650 g

Na2HPO4, anhidra

0,724 g

KH2PO4

0,210 g

Agua destilada

1000 mL


Disolver los ingredientes en el agua destilada. Ajustar el pH a 7.4 (con NaOH 1 N). Autoclave a 15 min a 121°C.

B.18.7.11 Solución salina al 0,85% en agua destilada

B.18.7.12 Antisuero polivalente V. cholerae O1 y O139

B.18.7.13 Bioquímicas miniaturizadas API 20 E o Método para identificación Bioquímica Alternativo.

B.18.8 Condiciones ambientales

El laboratorio donde se analicen las muestras debe estar previamente limpio y desinfectado y no debe rebasar de 15 colonias en 15 minutos de exposición de agar soya tripticasa o agar peptona-glucosa extracto de levadura. Pueden hacerse aproximaciones más exactas utilizando diferentes equipos de monitoreo, en ese caso deberán establecerse los limites considerando la calificación de las áreas y los resultados estadísticos del monitoreo.

Las placas deberán incubarse a 35 °C por 48 h y contar todos los microorganismos desarrollados sobre la placa.

B.18.9 Procedimiento analítico

B.18.9.1 Almacenamiento y transportación de las muestras.

Las muestras deberán ser refrigeradas inmediatamente después de ser recolectadas y ser analizadas tan pronto como sea posible. Debe evitarse el contacto directo de las muestras con hielo para aumentar la posibilidad de recuperar a los Vibrios. Los Vibrios pueden ser afectados por el congelamiento rápido, sin embargo se desarrollan rápidamente en productos de la pesca a temperatura ambiente, por lo que debe evitarse el choque térmico tanto a altas como bajas temperaturas, la supervivencia de los Vibrios es mejor en condiciones de refrigeración leve. Cuando se requiere almacenar las muestras en congelamiento, siempre que sea posible, deberá hacerse a -80 °C.

B.18.9.2 Enriquecimiento y aislamiento

B.18.9.2.1 Productos de la pesca (con excepción de los moluscos bivalvos) y vegetales.

Pesar 25 g de la muestra. Moler o cortar en piezas pequeñas con tijeras estériles. Adicionar 225 mL de agua APA y mezclar o moler por 2 minutos a alta velocidad.

Incubar a 35 ± 2 °C por 6 a 8 horas y continuar como se describe en “Aislamiento” para los alimentos que han sido procesados de alguna manera (calentados, congelados o deshidratados), reincubar la muestra 16 a 18 horas más y continuar como se describe en “Aislamiento”.

B.18.9.2.2 Moluscos bivalvos crudos en concha, desconchados frescos y congelados .Preparación de la muestra.

En general, deben tomarse un mínimo de 10 a 12 moluscos bivalvos, a fin de obtener una muestra representativa y permitir la selección de animales completos disponibles para su desconche. Con la mayoría de las especies, esto permite una adecuada selección y se obtendrán aproximadamente 200 g de licor y carne. Por otro lado 10 a 12 piezas de ciertas especies pequeñas de moluscos bivalvos, pueden producir mucho menos que 100 g de licor y carne por lo que se deben usar de 20 a 30 piezas de estas especies para obtener el peso adecuado.

B.18.9.2.2.1 Limpieza de la concha.

Lavarse las manos con agua potable y jabón antes de comenzar. Enjuagar el exceso de suciedad de las conchas y cepillar con un cepillo estéril bajo el chorro de agua potable poniendo particular atención en las hendiduras de las conchas. Colocar las conchas limpias en toallas de papel absorbente o gasas limpias. Desechar los moluscos que tengan las conchas dañadas o con las valvas abiertas.

B.18.9.2.2.2 Remoción del contenido.

Lavarse las manos con agua, jabón y enjuagarse con alcohol al 70%. Se puede utilizar guantes para evitar lesionarse. Sostener el molusco en la mano sobre una gasa dirigiendo la unión de las valvas o bisagra hacia el analista apoyándose sobre la mesa. Con un cuchillo desconchador estéril, insertar la punta entre las valvas y hacer palanca para cortar el músculo abductor. Drenar el licor de la concha dentro de un recipiente estéril. Cortar el músculo abductor de las conchas y pasar el cuerpo del animal dentro del mismo recipiente.

Pesar el total de la muestra, máximo 200 g (carne y licor) y adicionar igual cantidad de PBS para obtener una dilución 1:2. Homogeneizar por 2 minutos.

Preparar dos series de diluciones, pesando para cada una porciones de 50g del homogeneizado diluido 1:2 obtenido en el inciso anterior, en 200 ml de agua peptonada alcalina (APA). De esta dilución preparar las diluciones 1:100 y 1:1000, en 9 o 90 mL de agua peptonada alcalina.

Incubar una serie de diluciones a 35 °C ± 2 °C por 6 a 8 horas, continuar como se describe en el inciso B.18.9.3 “Aislamiento”. Re-incubar por 16-18 horas más, continuar como se describe en el inciso B.18.9.3 “Aislamiento”.

Incubar la otra serie de diluciones a 42 °C ± 0,2 °C por 6 a 8 horas, continuar como se describe en el inciso B.18.9.3 “Aislamiento”. Re-incubar por 16-18 horas más, continuar como se describe en el inciso B.18.9.3 “Aislamiento”.

Se podrá utilizar la siguiente recomendación como una segunda opción de análisis; pesar 50 g del producto y adicionarlos a 2450 mL de APA. Este matraz deberá ser incubado de 18 a 21 h a 42 °C ± 0,2 °C en un baño de agua.

B.18.9.2.3 Agua para consumo humano.

Filtrar 3 litros de agua a través de un filtro de membrana de 0.45 μm. Colocar la membrana en un tubo con 10 ml de APA e incubar a 35°C por 18-24 h. Continuar como se indica en el inciso B.18.9.3 “Aislamiento”.

Tabla 1. Resumen de Pruebas


Tipo de Producto

Cantidad de Muestra

Diluyente

Serie de Dilución

Temperatura de incubación

Resiembra

6 h

18 h

Moluscos Bivalvos crudos en concha, desconchados frescos y congelados (Carne y licor). El diluyente para dilución 1:2 es PBS

200 g muestra dilución 1:2


Pesar 50 g de la dilución 1:2

200 mL PBS

10-1 a 10-4

35 °C





10-1 a 10-4

42 °C





Agua para consumo humano

Filtrar 3 L por una membrana 0.45 μm

10 mL APA

No aplica

35 °C

-




B.18.9.3 Aislamiento

Transferir un inóculo del crecimiento de la superficie (en forma de película) de cada dilución de APA en agar TCBS y sembrar por estría cruzada para obtener colonias aisladas. Incubar a 35 ± 2 °C por 18 a 24 horas. Se puede utilizar también el agar mCPC, incubar a 39-40 °C, si no se tiene una incubadora a esa temperatura, es adecuado incubar a 35-37 °C ya que la selectividad del medio está dada principalmente por los antibióticos.

Las colonias características de V.cholerae en agar TCBS son amarillas, grandes (2-3 mm), lisas, ligeramente planas con centro opaco y translúcidas en la periferia. Las colonias típicas en agar mCPC son pequeñas, lisas, opacas de color verde o púrpura y con la superficie del medio púrpura que se extiende en toda la caja durante la incubación. (Adicionalmente pueden utilizarse medios cromogénicos que cumplan los criterios de control calidad, promoción de crecimiento y selectividad).

Seleccionar 3 o más colonias típicas de cada placa y sembrar cada una en agar T1N1 inclinado o en placa. Incubar a 35 ± 2 °C toda la noche. En caso de que no se tengan colonias aisladas, sembrar en agar selectivo (T1N3 o TSA 2 % de NaCl) para su purificación. Incubar a 35 ± 2 °C toda la noche.

B.18.9.3.1 Pruebas tamiz y confirmación.

A partir de los cultivos puros, realizar al menos las siguientes pruebas:

B.18.9.3.1.1 Agar arginina glucosa inclinado (AGS).

Inocular por picadura y estría cada cultivo sospechoso en agar arginina glucosa inclinado. Incubar a 35 ± 2 °C toda la noche con la tapa del tubo floja. Los cultivos de V. cholerae y V. mimicus producen una reacción alcalina en la superficie (púrpura) y ácido en el fondo (amarillo), por lo que la arginina no fue hidrolizada. Sin producción de gas ni H2S.

B.18.9.3.1.2 Tolerancia al NaCl

Inocular cada cultivo con un inóculo ligero a cada uno de dos tubos de caldo T1N0 y T1N3. Incubara 35 ± 2°C toda la noche. V. cholerae y V. mimicuscrecen sin NaCl.

B.18.9.3.1.3 Prueba del hilo

Esta es una prueba presuntiva útil para cultivos sospechosos de V. cholerae, todas las cepas son positivas. A partir de una colonia grande de agar T1N0, hacer una emulsión en una gota pequeña e desoxicolato de sodio al 0.5% en agua destilada estéril en un portaobjetos o caja petri con una asa o palillo estéril. Dentro de los 60 segundos siguientes o antes las células se lisan y el DNA forma una cuerda o hilo al levantar el asa o palillo de madera de 2 a 3 cm sobre el portaobjetos o caja petri, que indicará una prueba positiva.

B.18.9.3.1.4 Prueba de oxidasa

A partir de un cultivo de T1N1, colocar una asada sobre un papel filtro impregnado de reactivo de oxidasa (N,N.N.N´-tetrametil-p-fenilendiamino .2HCl). Un color púrpura oscuro desarrollado dentro de los siguientes 10 segundos sobre el papel filtro, indica una prueba positiva. Alternativamente se puede adicionar una gota del reactivo sobre el cultivo de T1N1.V.cholerae y V. mimicus son oxidasa positivos.

B.18.9.3.1.5 Pruebas bioquímicas.

En la tabla 1 se encuentran las pruebas bioquímicas características mínimas para identificar cepas de V.cholerae. La capacidad del V. cholerae para crecer en triptona al 1% sin NaCl a diferencia de otros Vibrios sacarosa positivos. Alternativamente se pueden utilizar las tiras de bioquímicas miniaturizadas como API 20E o Vitek. En la tabla 2 se encuentran otras pruebas bioquímicas complementarias para la identificación de V. cholerae.


Tabla 1. Características mínimas necesarias para identificar cepas de V. cholerae




Reacción positiva

Porcentaje

Bacilos gram negativos no esporulados

+

100

oxidasa

+

100

Prueba del hilo

±

100

L-lysinadecarboxilasa

+

100

L-argininadihidrolasa

-

0

L-ornitinadecarboxilasa

+

98,9

Crecimiento en caldo triptona al 1% a

+

99,1b

aSin NaCl

bV. cholerae (y V. mimicus)s Fuente. Hugh and Sakazaki (48)


Tabla 2. Bioquímicas características de Vibrios patógenos en humanos encontrados en productos del mar *

 

V. algi-nolyticus

V. cholerae

V. fluvialis

V. furnissii

V. hollisae

V. metschni- kovii

V. mimicus

V. parahae- molyticus

V. vulnificus

A. hydro-philia**

P. shigel- loides**

Agar TCBS

A

A

A

A

NC

A

V

V

V

A

V

Agar mCPC

NC

P

NC

NC

NC

NC

NC

NC

A

NC

NC

Agar CC

NC

P

NC

NC

NC

NC

NC

NC

A

NC

NC

AGS

KA

Ka

KK

KK

Ka

KK

KA

KA

KA

KK

nd

Oxidasa

+

+

+

+

+

-

+

+

+

+

+

Arginina dihidrolasa

-

-

+

+

-

+

-

-

-

+

+

Ornitinadecarboxilase

+

+

-

-

-

-

+

+

+

-

+

Lisinas decarboxilasa

+

+

-

-

-

+

+

+

+

V

+

Crecimiento en (p/v):

0% NaCl

-

+

-

-

-

-

+

-

-

+

+

3% NaCl

+

+

+

+

+

+

+

+

+

+

+

6% NaCl

+

-

+

+

+

+

-

+

+

+

-

8% NaCl

+

-

V

+

-

V

-

+

-

-

-

10% NaCl

+

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

Crecimiento a 42°C

+

+

V

-

nd

V

+

+

+

V

+

Acido de :

Sacarosa

+

+

+

+

-

+

-

-

-

V

-

D-Cellobiosa

-

-

+

-

-

-

-

V

+

+

-

Lactosa

-

-

-

-

-

-

-

-

+

V

-

Arabinosa

-

-

+

+

+

-

-

+

-

V

-

D-Manosa

+

+

+

+

+

+

+

+

+

V

-

D-Manitol

+

+

+

+

-

+

+

+

V

+

-

ONPG

-

+

+

+

-

+

+

-

+

+

-

Voges-
Proskauer

+

V

-

-

-

+

-

-

-

+

-

Sensibilidad a:

10 µg O/129

R

S

R

R

nd

S

S

R

S

R

S

150 µg O/129

S

S

S

S

nd

S

S

S

S

R

S

Gelatinasa

+

+

+

+

-

+

+

+

+

+

-

Ureasa

-

-

-

-

-

-

-

V

-

-

-

* Adaptado por Elliotet al. (31)

** Aeromonashydrophila, Plesiomonasshigelloides

Abreviaciones: TCBS, thiosulfaoe-citrato- saltes biliares -sacarosa; mCPC, cellobiosa-polimyxinamodificado B-colistin; AGS, arginine-glucoseinclinado;

A=amarillo NC = no crecimiento o pobre crecimiento S = suceptible nd = no realizado

V= verde V = variable entre especies entre cepas R = resistente P = púrpura, V = variable

KK = Alcalino en la superficie / Alcalino en el fondo KA = Alcalino en la superficie /ácido en el fondo, Ka = Alcalino en la superficie/ Ligeramente ácido en el fondo

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